摘 要：采用顯微成像熒光光譜系統(tǒng)對退變（病變）的軟骨及健康軟骨樣本不同深度位置進行顯微探測和熒光光譜采樣。結(jié)果顯示：在非鈣化區(qū)，退變樣本的３４０／４１４nm 熒光光譜強度低于健康樣本，而在鈣化區(qū)和骨質(zhì)區(qū)，退變樣本熒光強度則高于健康樣本；２ 類樣本在鈣化區(qū)和骨質(zhì)區(qū)的熒光光譜強度均高于非鈣化區(qū)。利用顯微成像熒光光譜技術(shù)研究關(guān)節(jié)軟骨提供了一定的實驗依據(jù)和病變特征，有助于相關(guān)疾病的早期監(jiān)測及診斷研究。

顯微成像熒光光譜技術(shù) 利用該技術(shù)可以同時獲得樣品的熒光光譜信息以及顯微形貌，有利于同時實現(xiàn)其組織內(nèi)部成分及外部微觀形態(tài)的觀測。此外，該技術(shù)具有檢測速度快、信號強度高、對樣品要求低、易于標記、活體測量不易受水分影響等優(yōu)點，因而被廣泛運用于多個領(lǐng)域的基礎(chǔ)科學(xué)研究及應(yīng)用研究。

生物熒光光譜技術(shù)可以檢測光和組織的相互作用，并提供有關(guān)分子、細胞和組織的生物化學(xué)和形態(tài)學(xué)信息，是生物醫(yī)學(xué)研究和診斷的１ 個重要手段。它的２ 個至關(guān)重要的熒光光譜特征參量是熒光強度和波長。前者是在激發(fā)光的作用下樣品所發(fā)射的熒光強度，它與激發(fā)光的波長、樣品的構(gòu)成、分子結(jié)構(gòu)、濃度、所處的環(huán)境等因素有關(guān)，反映相關(guān)熒光物質(zhì)的分子屬性及含量。

關(guān)節(jié)軟骨是一類透明軟骨，表面平滑，有利于關(guān)節(jié)的彎曲、潤滑、減震和緩沖等，在人和動物的日常運動中發(fā)揮著重要的生理功能。軟骨主要由軟骨基質(zhì)和軟骨細胞組成，軟骨基質(zhì)的主要成分為膠原蛋白和蛋白多糖、以及水和少量無機離子。

關(guān)節(jié)軟骨從軟骨外表面至骨質(zhì)之間可分為非鈣化區(qū)（含表層區(qū)（SZ） 、過渡區(qū)（TZ）和深層區(qū)（DZ））與鈣化區(qū)（CZ） ，深層區(qū)與鈣化區(qū)之間有１ 條潮線相隔，鈣化區(qū)下方為骨質(zhì)區(qū)。在關(guān)節(jié)軟骨的各個分區(qū)內(nèi)，各主成分的含量及結(jié)構(gòu)均有不同。當(dāng)膠原網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，PG 出現(xiàn)流失時，即意味著軟骨退變甚至骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。

目前，已有一些科學(xué)家針對關(guān)節(jié)軟骨進行了熒光光譜研究。１９９１ 年，Akiyoshi［３ ］ 分析了老化的人關(guān)節(jié)軟骨的熒光特性，指出戊糖的波長為３３５／３８５nm ，嘧啶為２９５／３９５ nm 。２００１ 年，Gibson 等 觀察到了３７０／４４０ nm 附近的特征峰，并提出該特征峰代表了糖化膠原的熒光強度。２０１２ 年，Kinnunen 等利用蘇阿糖溶液對軟骨樣本進行培養(yǎng)來模擬軟骨退變，并通過熒光分光光度計檢測到了糖基化終產(chǎn)物（AGE）的積累，以及戊糖和賴氨酸嘧啶濃度的增加。２０１６ 年，國內(nèi)研究者對軟骨的熒光顯微檢測方法進行了研究，對熒光強度圖像進行了統(tǒng)計處理，發(fā)現(xiàn)了健康樣本與病變樣本的差異，并基于熒光的偏振敏感特性，利用線性二色性方法揭示了軟骨組織存在的熒光各向異性特征。但過去的這些研究都沒有能夠?qū)晒夤庾V和顯微成像相結(jié)合進行軟骨（及下骨）病變條件下的主成分含量變化研究。

由于關(guān)節(jié)軟骨的特征構(gòu)成，其主成分的（自發(fā)）熒光特征（強度）也相對比較明顯。因此，利用顯微成像熒光光譜技術(shù)對其進行研究和表征，將會獲得非常明顯而具說服力的結(jié)果，為后續(xù)的關(guān)節(jié)疾病研究和相關(guān)應(yīng)用奠定堅實的基礎(chǔ)。

以下為研究者所做的樣品實驗圖

退變樣本由表及里依次標記為A 、B 、C 、D 、E 、F 、G 和骨質(zhì)區(qū)；

健康樣本由表及里依次標記為A 、B 、C 、D 、E 、F 和骨質(zhì)區(qū)。

圖1 退變和健康軟骨樣本的顯微成像

１ — ３ 分別來自健康樣本A 、C 、B ；

４ — ６ 分別來自退變樣本C 、A 、B ；

７為背景光譜。

圖2 軟骨的熒光光譜（以５４０nm 譜帶為歸一化內(nèi)標）

所有熒光光譜。隨著采樣位置深度的增加（A → 骨質(zhì)區(qū)） ，熒光強度逐漸增加，尤其是從非鈣化區(qū)到鈣化區(qū)。所不同的是，健康樣本骨質(zhì)區(qū)的熒光強度分別高于鈣化區(qū)和軟骨區(qū)，而退變樣本骨質(zhì)區(qū)的熒光強度則低于鈣化區(qū)熒光強度。

結(jié) 論

采用顯微成像熒光光譜技術(shù)，對健康軟骨切片樣本與退變軟骨切片樣本的顯微成像和熒光光譜進行了分析，獲得了熒光特征強度隨深度的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)了退變發(fā)生時軟骨中主成分的變化情況，為軟骨退變及骨關(guān)節(jié)炎的研究打下了基礎(chǔ)。

以上文章部分內(nèi)容引自南京航空航天大學(xué)自動化學(xué)院尹建華教授相關(guān)文獻，特此感謝！